La historia mítica de Laocoonte fue narrada por Virgilio en la Eneida. La presencia literaria del sacerdote de Apolo fue vivamente agigantada cuando, en 1506, se descubrió en Roma el grupo escultórico de Laocoonte y sus hijos mordidos por las serpientes. La estatua, realizada en el siglo II a.c por Agesandro, Atenodoro y Polidoro de Rodas, fue ensalzada ya en los tiempos antiguos por Plinio el Viejo. En el momento del desentierro de la escultura helénica se hallaba presente Miguel Ángel. La perfección en la representación del cuerpo humano en esta obra generó una fundamental influencia en la búsqueda de los artistas del Renacimiento de la exacta proporción y armonía de la anatomía humana. Sin embargo, la inspiración del Laocoonte del Greco no fue el relato de Virgilio, sino narraciones más antiguas, como la de Arctinos de Mileto. También se ha querido hallar similitudes entre su pintura y El Galo herido del Museo arqueológico de Venecia.
Para realizar las figuras desnudas de Laocoonte y sus hijos tomó imágenes anteriores, debido a su idea de la perfección; si ya consideraba alguna figura perfecta la representaba en más de una ocasión. A la izquierda, el hijo del sacerdote de Apolo atacado se asemeja al desnudo de la derecha en La visión apocalíptica; el rostro de Laocoonte es el de Las lágrimas de San Pedro. Pero más allá de estas semejanzas formales, lo más relevantes es la naturaleza del espacio donde transcurre el ataque de las serpientes y la muerte de Laocoonte y sus hijos. El sacerdote de Apolo yace derrumbado, pero lucha contra el reptil. No se resigna a la muerte. Junto a él, descansan en un sueño sin regreso, su hijo muerto. A la izquierda, el otro hijo aprisiona con brío a una de las serpientes. La aferra y tensa cual si fuera un arco. Pero la cabeza del reptil se acerca a su pecho, donde descargará su veneno. En las tres figuras, que destacan por su movilidad, encontrando ecos del Manierismo romano que El Greco conocía. Sin embargo, se aprecia que el cretense se aleja totalmente del grupo escultórico helenístico que tanto había atraído a Miguel Ángel.
Al fondo, se yerguen la ciudad amurallada de Toledo. El caballo de madera de Ulises avanza hacia la puerta de la Bisagra, entrada a la ciudad del siglo XVI, convertida en una versión moderna de la antigua y orgullosa urbe sitiada por los aqueos. Sería lógico pensar en una interpretación intemporal de lo que le ocurrió a Laocoonte al aparecer la ciudad castellana. También podría ser una referencia a la tradición según la cual Toledo había sido fundada por dos descendientes de los troyanos, Telemón y Bruto. 

Al fondo encontramos una vista de Toledo, no de Troya, situando al caballo frente a la puerta de Bisagra. Sería lógico pensar en una interpretación intemporal de lo que le ocurrió a Laocoonte al aparecer la ciudad castellana. También podría ser una referencia a la tradición según la cual Toledo había sido fundada por dos descendientes de los troyanos, Telemón y Bruto.