La capilla mayor de la basílica es la zona más rica e importante de todo el Monasterio. Se diferencia claramente del resto, ya que aquí está el Santísimo Sacramento, resguardado en el Tabernáculo. La idea de resaltar esta zona del presbiterio, desde el punto de vista dogmático de exaltación de la Eucaristía y como dinástico, se consigue plenamente por ser la única parte del edificio que se recubre con ricos mármoles policromos y bronces dorados; tienen el colorido de las pinturas murales y del retablo, frente a la desnudez gris del resto de la basílica, en donde se utiliza exclusivamente piedra berroqueña.
La bóveda del presbiterio recibe entre 1584 y 1585 una interesante decoración de pintura mural, ajena al programa de frescos de la basílica del siglo XVII, con uno de los temas de mayor exaltación mariana, la Coronación de la Virgen por la Santísima Trinidad. El tema se acompaña con los cuatro profetas mayores del Antiguo Testamento -Daniel, Ezequiel, Isaías y Jeremías-, que se representan en las enjutas sentados sobre nubes. Su autor es el genovés Luca Cambiaso.

El retablo principal
El retablo mayor fue contratado en 1579 por los escultores Jacopo da Trezzo y Pompeo Leoni y el maestro de cantería Juan Bautista Comane, bajo las trazas de Juan de Herrera. Jacopo haría el Tabernáculo y Comane y su hermano Pedro Castello, la obra de jaspe y mármol, que incluía los principales elementos arquitectónicos del retablo, las mesas de altar, el pavimento y las gradas de mármol del presbiterio. Leone y Pompeo Leoni se encargan de toda la escultura en bronce y de los elementos arquitectónicos de ese mismo material, como basas, capiteles, cornisas y modillones (1582-1589). Sus grandes proporciones obedecían no sólo a la tradición retablística española, sino también a la consideración del uso cortesano de la Basílica, que obligaba a que el retablo fuera observado por los fieles desde una gran distancia. De ahí, también la preocupación por la claridad y la sencillez con que se habían de representar las historias de sus pinturas.
Las pinturas del altar mayor conforman uno de los más completos conjuntos de estilo manierista tardío toscano y romano en España. La iconografía del retablo, incluyendo las esculturas de Leone y Pompeo Leoni, representa el camino de la salvación a través del Nacimiento, la Pasión, Muerte y Resurrección de Cristo. En un principio, todas las obras pictóricas se encomendaron a Navarrete en enero de 1579, pero por su pronta muerte dos meses después, no llegó a realizar ninguna de ellas, las cuales se encargaron de nuevo en 1587 a Federico Zuccaro. Pero, a juicio del rey, no todas sus pinturas se representaron con la claridad, corrección o decoro debidos. Por eso, apenas se fue el artista de España, tras su despedida forzosa en diciembre de 1588, el rey decidió hacer diversos cambios.
El Octavo Diseño grabado por Pedro Perret en 1589 sobre los dibujos de Juan de Herrera, es muy importante para la historia de la pintura escurialense, ya que es el único testimonio de cómo estaba el retablo mayor de la Basílica con todas las pinturas de Zuccaro antes de las modificaciones que Felipe II mandó introducir. Se sustituyó el tema principal del retablo, el Martirio de san Lorenzo, y los dos cuadros de su cuerpo inferior, a derecha e izquierda del Tabernáculo, con la Adoración de los pastores y la Adoración de los Reyes, por otras nuevas versiones de Pellegrino Tibaldi en 1592, para las que el artista ideó unos magníficos nocturnos, consiguiendo unas de sus mejores obras

A la izquierda, La Adoración de los Magos de Federico Zuccaro, 1587. Patrimonio Nacional, Real Monasterio de San Lorenzo de El Escorial. A la derecha, la Adoración de los Magos de Pellegrino Tibaldi,1592, que se encuentra actualmente en el retablo de la Basílica. Pero en este mismo lugar, ya habían estado antes la Anunciación de Veronés y el Nacimiento de Tintoretto, y al final se ordenó que no se colocaran, el primero, por no ser el tema a representar, y, el segundo, por la idea de mantener una coherencia estilística para todo el conjunto. Otras obras de Zuccaro simplemente se repintaron para ajustarse al decoro, como la Virgen de la Asunción, que se transformó en una figura más sosegada, encargándose la tarea al oscuro pintor madrileño Juan Gómez en 1596.
Cambios de la tabla central: El martirio de San Lorenzo
El martirio de San Lorenzo que vemos hoy en el retablo es la cuarta obra que allí se puso, lo que delata el cuidado que se prestó a este emplazamiento. Como estaba colocado en un lugar clave dentro del retablo, no se salió del estricto programa pedagógico que se imponía en la basílica. La obra fue encargada a Tiziano (ver abajo), pero por diversos problemas, no se colocó aquí. Después llegó otro San Lorenzo de Lucas Cambiaso, que tampoco fue del gusto del monarca. El tercero fue encargado a Federico Zuccaro y resultó igualmente un fracaso, retirándose inmediatamente y habiéndose perdido su pista con el paso de los años. Frente a todos estos competidores, el monarca prefirió la pintura de Peregrino Tibaldi (arriba), más expresiva y didáctica, es decir, más evidente, a pesar de tratarse de un cuadro con escasa perspectiva y con una distribución de los personajes que resulta demasiado forzada.
Martirio de San Lorenzo de Tiziano
Este es el Martirio de San Lorenzo contratado y realizado por Tiziano y que debiera haber estado en el retablo. El cuadro resultaba algo intimista y oscuro, de ambientación nocturna y escasamente didáctico; además, su medida no encajaba con exactitud dentro del hueco previsto, así que se optó por no colocarlo aquí. La parrilla que aparece en primer término destaca sobre un fondo lóbrego que correspondía a las supuestas celdas donde se encontraba el santo, en un ambiente nocturno tan sólo iluminado por el fuego y las antorchas. No es necesario decir que se trata de una obra admirable, producto de un Tiziano ya a punto de morir, obra que Felipe II se encargó de que fuera generosamente pagada. La pintura había sido apreciada y justamente valorada, pero no se consideró la más adecuada para el retablo de la basílica.