Este retrato ecuestre fue pintado en Augsburgo en 1548 para conmemorar la victoria de las tropas del emperador Carlos V sobre la Liga de Smalkalda en Mühlberg el 24 de abril de 1547. La obra no tenía precedentes en la pintura italiana. Es posible que influyeran en Tiziano obras como la estatua ecuestre de Marco Aurelio, el Colleoni del renacentista Verrocchio o alguna obra del arte alemán. Es una obra excepcional ya que inaugura un género que hasta el momento se había tratado muy tímidamente y que alcanza su esplendor en el Barroco: el retrato real a caballo. Pero no tuvo repercusiones inmediatas en el retrato ecuestre; habrá que esperar al XVII para ver los retratos ecuestres de Velázquez o Rubens. La propaganda imperial presentó esta guerra como un conflicto político y no religioso destinado a castigar a quiénes se habían sublevado contra su señor. De hecho, destacados nobles luteranos apoyaron a Carlos y a su hermano, el archiduque Fernando (futuro emperador), en cuyo ejército eran mayoría los protestantes. Tiziano, que quiso realizar una imagen muy directa del emperador,  se inspiró en el Comentario de la guerra de Alemania de Luis de Ávila y Zúñiga de 1551. Aquí se lee: "[...] Y el Emperador paró en un prado que estaba en medio del bosque, donde hizo recoger alguna gente de armas, porque estaba toda tan esparcida que tan sin orden andaban los vencedores como los vencidos."[...] Iua el Emperador en un cauallo Español castaño oscuro, el cual le auia presentado mosir de Ri cauallero dela orden del Tuson, y su primer camarero, lleuaua vn caparaçon de tercio pelo carmesí con franjas de oro, y unas armas blancas y doradas, y no lleuaua sobre ellas otra cosa, sino la vanda muy ancha de tafetán caresi listada de oro, y vn morrión Tudesco, y vna media hasta casi venablo en las manos." [...] Y el Emperador paró en un prado que estaba en medio del bosque, donde hizo recoger alguna gente de armas, porque estaba toda tan esparcida que tan sin orden andaban los vencedores como los vencidos." [...] Iba el Emperador en un caballo español castaño oscuro el cual le había presentado mosiur de Rin, caballero del orden del Tusón, y su primer camarero, llevaba un caparazón de pelo carmesí con franjas de oro, y unas armas blancas y doradas y no llevaba sobre ella otra cosa sino la banda muy ancha de tafetán carmesí listada de oro, y un morrión tudesco, y una media asta, casi venablo, en las manos.

Erwin Panofsky (1892- 1968) señala la convergencia en esta imagen de dos nociones no excluyentes entre sí, al mostrar a Carlos V como heredero de la tradición romana y encarnación del miles christianus (soldado cristiano), tal como lo caracterizara Erasmo de Rotterdam en el manual del caballero cristiano, titulado Enchiridion. Significado acorde a ambas interpretaciones tendría la lanza, alusión a la de Longinos (soldado romano que clavó su lanza en el costado de Cristo y que se convirtió al cristianismo) y arma de San Jorge, caballero cristiano por excelencia, pero símbolo también del poder supremo de los césares.

Carlos V va pertrechado al modo de la caballería ligera, con media pica y pistola de rueda en el arzón delantero de la silla de montar. Lleva una armadura realizada hacia 1545 por Desiderius Helmschmid, en cuyo peto, y como era habitual desde 1531, aparece una imagen de la Virgen con el Niño. Protege la cabeza con un morrión de tres crestas sogueadas cubierto por un forro de cuero de piel gris mate, al que Tiziano aplicó ligeras pinceladas para dar efecto de pelo. La armadura del Emperador se conserva en la Armería Real del Palacio Real de Madrid (abajo).

Tiziano utilizó la técnica colorista propia de la pintura veneciana y la aplicó con gran sabiduría a los brillos de la armadura, al rojo y a los reflejos dorados de la gualdrapa del caballo.

Cuidó la iluminación y sentido atmosférico del paisaje en el que enmarca al personaje. El paisaje aparece iluminado por las luces del crepúsculo, en cuya parte derecha aparecen unas brumas, una pequeña construcción y las ciénagas y estanque, aún hoy características, de la ribera del Elba.